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　　ELISA實驗常見問題分析與解決方案

　　一、顯色異常問題

　　白板(無顯色)?

　　原因?：試劑失活(如HRP污染或底物失效)、漏加關鍵組分(酶標抗體/顯色劑)、孵育溫度或時間不足?。

　　解決?：更換新鮮試劑，檢查加樣步驟，確保37℃孵育1-2小時并避光?。

　　高背景/非特異性顯色?

　　原因?：封閉不充分(如BSA濃度不足)、洗滌不凈(殘留未結合物質(zhì))、抗體濃度過高或交叉反應?。

　　解決?：優(yōu)化封閉條件(延長至1-2小時)，增加洗滌次數(shù)(5次，每次1分鐘)，調(diào)整抗體稀釋比例?。

　　二、重復性差

　　加樣誤差?：復孔間加樣量或時間不一致，導致CV%>20%?。

　　洗板不均?：洗板機管道阻塞或手工洗板力度不一致?。

　　解決方案?：使用同一移液器，規(guī)范加樣速度;檢查洗板機或手動充分拍干?。

　　三、假陽性/假陰性

　　假陽性?

　　溶血/細菌污染?：紅細胞釋放過氧化物酶或細菌內(nèi)源性HRP干擾?。

　　類風濕因子(RF)?：與IgG Fc段非特異性結合?。

　　處理?：離心去除溶血樣本，添加RF阻斷劑?。

　　假陰性?

　　抗原降解?：反復凍融或保存時間過長?。

　　競爭法操作錯誤?：如先加酶標抗體后加樣本?。

　　處理?：分裝凍存樣本，嚴格按說明書順序加樣?。

　　四、標準曲線異常

　　標曲擬合差(R2<0.99)?：標準品稀釋錯誤或酶標儀波長設置不當?。

　　批間差異?：不同批次試劑活性波動，可用校正因子“S"校準歷史數(shù)據(jù)?。

　　五、關鍵操作注意事項

　　加樣?：槍頭懸空加至孔底，避免觸碰孔壁或濺灑?。

　　孵育?：覆蓋封板膜防止蒸發(fā)，避免疊放導致溫度不均?。

　　洗滌?：使用含0.05% Tween-20的洗滌液，拍干?。

　　六、其他常見問題

　　邊緣效應?：周邊孔顯色偏強，建議質(zhì)控孔置于板中央?。

　　酶標板選擇?：聚苯乙烯板需評估吸附性能，避免批次差異?。

　　(注：具體問題需結合試劑盒說明書及實驗條件調(diào)整?。)

　　注：以上資料僅供參考，不作為實驗數(shù)據(jù)，具體請咨詢品牌供應商或技術老師;

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